欧美,日韩在线视频-天天爽夜夜爽人人爽-无码一区二区三区在线观看-来一水AV@lysav

 1　實驗方法

1.1　混合抗原直接測試　
按豚鼠膜迷路蛋白抗原性分析文章講述的方法［1］，將1.2ml大鼠原血清加入7.0ml10％丙烯酰胺溶液，聚合后在10°C、200mA、2h條件下大鼠血清蛋白電泳吸附于NC膜，用蒸餾水漂洗后，切一10×100mm小條裝入10ml試管備用。對照組將同樣面積空白NC膜用蒸餾水漂洗后備用。在上述裝有NC膜的試管中加入10ml DMSO，充分搖勻，室溫1h；加入等體積0．1mol／L　pH9．0碳酸氫鈉溶液，充分混勻。3000r／min離心3～5min，收集沉淀，即為含大鼠血清蛋白的NC膜微粒，用0．01mol／L　pH7.4　PBS-T洗滌離心3×5min；用含0.3％的1：50正常羊血清封閉、阻斷37°C30min或4°C冰箱過夜；同上離心后用PBS將微粒體積調至5ml、用0.5ml離心管分裝，每管加入100μl微粒懸濁液；在各管中分別加入100μl倍比稀釋的HRP-羊抗鼠，37°C孵育30min；同上洗滌離心3次，加入100μl含0.1mol／L檸檬酸、0.2mol／L磷酸氫二鈉、雙氧水、鄰苯二胺底物溶液，于37°C暗環(huán)境反應120min；每管加入1滴2mol／L硫酸終止反應，同上離心，收集上清并加入96孔ELISA試劑盒酶聯(lián)板，用酶標儀測試波長490nm處OD值。重復測試3次。

1.2　電泳分離抗原測試　
首先免疫轉印鑒定抗原，再根據免疫轉印結果進行定位，將特定抗原帶裁下，測量NC膜面積，同上將NC膜微粒化處理并進行定量免疫測試。

2　實驗結果

用混合抗原直接測試和用電泳分離抗原進行測試，抗體濃度與OD值間均有較好線性關系，當抗體濃度為0.25～1．0ng／ml時線性，且陽性組和陰性對照組OD值落在*范圍（見表1），即陰性對照組OD值為0.3左右，陽性對照組為1.0左右。3次重復結果一致。
3　討論
用ELISA法進行測試時，包被條件非常關鍵，對用于包被的抗原或抗體要求較高，其應用范圍受限制。NC膜具有很強的吸附能力，從而出現了以該材料為基礎的斑點免疫檢測法［2～4］。其對被吸附的抗原要求不高，粗制抗原便可用于檢測，但吸附時間長、費時，被吸附抗原如果含有表面活性劑便不能用于檢測。為了克服上述缺點，我們曾建立了一種電泳吸附斑點免疫法［1］，但該法需要將NC膜逐一截成小圓片放入酶聯(lián)板中，操作也不方便，定量不夠準確。NCMPE法將電泳吸附抗原的NC膜變成微顆粒，分裝方便，能保證其均一性，定量準確，由于在離心管中操作、洗滌等處理極為方便。免疫轉印技術是抗原抗體檢測方面的重大突破，但應用該方法難以將抗體定量。NCMPE法將免疫轉印識別的特定抗原帶處理成微顆粒，然后用ELISA法定量測試抗體水平，充分發(fā)揮了免疫轉印技術的高分辨率和ELISA定量法的高度性與高度靈敏性，可極為方便而準確地將某種未知抗體定量。