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抗原檢測(cè)出的分子量比資料上的大,是怎么回事?
答:a)抗原形成了二聚體。增多巰基乙醇量,煮沸變性時(shí)間延長(zhǎng),可以打開(kāi)二聚體。b)蛋白本身的修飾如:糖基化,磷酸化等
蛋白轉(zhuǎn)移不到膜上,但膠上有,同時(shí)Marker 轉(zhuǎn)上去了,為什么?
答:可能是:a)樣品濃度過(guò)低;b)轉(zhuǎn)移時(shí)間不夠,。
要驗(yàn)證某個(gè)細(xì)胞上有無(wú)該蛋白的存在,需要做免疫組化和western blot試驗(yàn)嗎?做這兩個(gè)試驗(yàn)時(shí)的一抗和二抗可以共用嗎?
答:①免疫組化可以用來(lái)進(jìn)行定位,但是不能定量,而且有時(shí)會(huì)有假陽(yáng)性,不易與背景區(qū)分;Western blot可以特異性檢測(cè)某個(gè)蛋白質(zhì)分子,進(jìn)行定量,但是不能定位。
②兩種實(shí)驗(yàn)的一抗有時(shí)候不能通用,公司的產(chǎn)品說(shuō)明一般都會(huì)說(shuō)明可以進(jìn)行什么實(shí)驗(yàn),在免疫組化時(shí),是否適合石蠟切片或者冰凍切片。
細(xì)胞水平要做western blot,多少細(xì)胞提的蛋白夠做western blot?
答:一般5×10^6就足夠了
同一樣品能同時(shí)提RNA又提蛋白么?這樣對(duì)western blot有無(wú)影響?
答:能,沒(méi)有問(wèn)題。
同一蛋白樣品能同時(shí)進(jìn)行兩種因子的Western Blot檢測(cè)嗎?
答:當(dāng)然可以,有的甚至可以同時(shí)測(cè)幾十種樣品。
如果目標(biāo)蛋白是膜蛋白或是胞漿蛋白,操作需要注意什么?
答:如果是膜蛋白和胞漿蛋白,所用的去垢劑要溫和得多,這時(shí)加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。
我的樣品的蛋白含量很低,每微升不到1微克,但是在轉(zhuǎn)膜時(shí)經(jīng)常會(huì)發(fā)現(xiàn)只有一部分蛋白轉(zhuǎn)到了膜上,就是在轉(zhuǎn)膜后染膠發(fā)現(xiàn)有的孔所有的蛋白條帶都在,只是顏色變淡了,有什么辦法可以解決?
答:你可以加大上樣量,沒(méi)有問(wèn)題,還有轉(zhuǎn)移時(shí)你可以用減少電流延長(zhǎng)時(shí)間,加20%甲醇
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